illumina DNA测序仪常见故障维修分析：您将在下面找到一些与 DNA 测序相关的常见问题以及这些问题的可能原因和解决方案。在描述问题、如何识别问题、原因和问题的潜在解决方案的信息上方显示了序列跟踪的图片。序列数据可能会出现其他问题，但下面列出的是常见的问题。

1、illumina DNA测序仪压缩顺序问题维修：

序列显示为多个重叠轨迹，并不总是贯穿整个序列

如何识别：序列数据在序列中的一个点之后开始显示多个重叠迹线，尽管测序信号仍然很强。压缩现象和受污染的illumina DNA 制备物可能看起来相似，但受污染的制备物通常会在插入克隆位点后立即显示重叠痕迹。

原因：具有相同电泳迁移率的不同大小的 DNA 片段，即在电泳过程中在彼此顶部迁移的片段。这种现象被认为是由模板 DNA 中的二级结构区域引起的，这些区域通常但不总是出现在具有高 G/C 或高 A/T 含量的区域。

解决方案：

将 DMSO 添加到illumina测序反应的 5% (v/v) 浓度。在循环测序前将反应在 96°C 下孵育 10 分钟。循环前将所有反应组分加倍并在 98C 下孵育 10 分钟。（注意：反应组分加倍以说明因较高的变性温度而失活的酶量。使用测序试剂稀释缓冲液时不要使用此溶液）用限制酶线性化质粒。如果样品是 PCR 产物，尝试用 7-deaza-dGTP 代替 PCR 中 75% 的 dGTP 扩增 DNA，然后对illumina PCR 产物进行测序。选择靠近压缩位点的新引物，这有助于避免二级结构的影响。

2、illumina DNA测序仪污染质粒 DNA 的制备问题维修：

污染的质粒 DNA 制备导致序列数据中的重叠峰。

如何识别：序列数据清楚地显示到插入克隆位点的末尾，在这一点上，通常可以看到其他峰下方的峰。在坏的情况下，峰会相互遮挡，使整个序列无法读取。

原因：为单个质粒制备挑选多个克隆，或挑选包含两个或多个质粒的单个菌落，每个质粒都有不同的插入片段。

解决方案：在干净的环境中小心地从您的平板中挑选一个菌落到您的生长培养基中。在 DNA 制备后，通过限制性消化和琼脂糖凝胶分析验证您的单个菌落是否包含您感兴趣的插入片段。